Nature Nanotechnology｜从头设计可对 pH 响应的自组装螺旋蛋白丝
今天要和大家分享一篇来自华盛顿大学（University of Washington）蛋白设计研究所（Institute for Protein Design, IPD）的文章，发表在 Nature Nanotechnology（2024 年 7 月刊）上，题为：
《De novo design of pH-responsive self-assembling helical protein filaments》
（“从头设计可对 pH 响应的自组装螺旋蛋白丝”）
这篇论文的通讯作者是蛋白设计领域的标志性人物 David Baker 教授，第一作者为 沈浩（Hao Shen）博士 —— 他是 Baker 团队的重要成员，长期从事“蛋白质自组装体系的计算设计”。这项工作由华盛顿大学、剑桥大学、以及太平洋西北国家实验室多方合作完成。
这篇文章的核心问题是：
“我们能否用计算机设计出一类能感知环境变化、并像天然材料一样自发重构的蛋白质结构？”
简单来说，研究团队成功地 从头设计（de novo design）了一种在 pH 改变时能自行组装或解组的螺旋蛋白纤维。而且这种响应极为灵敏——仅仅 0.3 个 pH 单位的变化，就能让纤维在几百毫秒内“瞬间消失”；当 pH 恢复时，它们又会重新长回去。
在接下来的内容中，我们将带大家一起从图文角度出发，看看 Baker 团队是如何一步步实现这个看似“自然界才会做的事”：
他们如何在计算机中设计这种 pH 响应的自组装单元；
如何通过 冷冻电镜（Cryo-EM）验证原子级精度的结构一致性；
以及如何用显微镜和 AFM 动态观察 纳米级“丝的生与灭”。
一、从自然界的智慧到计算机的设计
自然界早已在分子层面玩出了“环境响应材料”的巅峰操作。
当蜘蛛在吐丝时，丝蛋白在腺体内会经历一个从中性到酸性的微小 pH 变化——这种变化就像一个分子开关，使蛋白质链自发组装成坚韧的丝纤维。
在酵母中，CTP 合酶在低 pH 条件下聚合成丝状结构，帮助细胞在饥饿时维持代谢平衡；而某些细菌的 R bodies，则能在酸性环境下“伸展爆裂”，突破宿主膜释放物质。
这些例子共同说明了一件事：pH 变化可以被生物系统精准地“编程”成结构变化的信号。
但是，要从零开始设计一种能像天然体系那样精准响应的人工蛋白丝，却非常困难。
天然系统依赖数百万年的演化优化，而人工设计需要计算机在原子层级上同时考虑折叠稳定性、组装几何、以及响应性残基的网络效应——这几乎是“分子工程中的珠穆朗玛峰”。
1. Baker 团队的构想：从 pH 响应三聚体出发
研究团队选择以一个已经验证过的 pH 响应三聚体结构（pRO-2.3） 为基础。
这个三聚体内部埋藏着 六个组氨酸（His）残基，它们通过氢键网络稳定整个结构。
当 pH 降低、组氨酸被质子化时，氢键网络被破坏，三聚体就会解体——这正是一个“天然的分子开关”。
在图 1a 的上半部分，可以看到研究者通过添加短 连接肽环（loop） 把这三个亚基连成了一个单链结构单元（monomer）。
这样一来，他们打破了原本的三重对称性，为后续设计“非对称界面”创造了空间。
而在图 1a 的下半部分标出了那些关键的氢键网络——其中每个组氨酸都像一个敏感的触点，决定着结构何时会“开”与“关”。
2. 从单体到纤维：计算设计的螺旋装配
接下来，研究团队利用 Rosetta 设计平台，探索了 45,000 种可能的螺旋堆叠方式。
他们像搭积木一样，让这些单体沿着不同的旋转角度与上升距离组合成各种螺旋模型（Fig. 1b）。
每种构型都经过能量评估、形状互补性和界面面积的筛选，最终选出了 18 种能量最低、理论上最稳定的方案。
在图 1c 中，每个亚基用不同颜色的棒状螺旋表示，之间的红色棒状结构就是 pH 敏感的氢键网络。
这些“带有敏感神经的模块”堆叠在一起，就构成了一根可以对环境微小变化迅速响应的蛋白质丝。
最终，18 种候选设计在 E. coli 中表达后，只有两个设计成功形成丝状结构——DpHF7 与 DpHF18。
这意味着，计算预测的能量最低模型，确实能在实验中自组装成纤维，验证了设计逻辑的可行性。
二、从计算机到显微镜：原子级别的“精准复刻”
当设计完成后，最关键的问题是：
“计算机画出来的蛋白丝，真的能在实验中按照那个形状自组装吗？”
这正是 Fig. 2 要回答的核心问题。研究团队通过 冷冻电镜（Cryo-EM），分别解析了两种设计的结构：
早期版本 DpHF18 和优化后的 DpHF19。
- 结构验证：从模型到真实结构
在 Fig. 2a 的第一列，是计算机预测的设计模型；第二列，是冷冻电镜拍到的纤维照片；第三、第四列分别展示了 DpHF18 和 DpHF19 的三维密度图。
可以清楚地看到：
DpHF18 虽然能形成纤维，但实际装配方式略有偏差；
DpHF19 经过五个关键位点突变后，结构与模型几乎完美重合（界面残基 RMSD 仅 1.4 Å！）。
这意味着，Baker 团队在原子层面实现了结构设计与实验结果的对齐。
这在“从头蛋白设计（de novo design）”领域是极其罕见的成就。
2. 从反平行到完美对称：五个突变的艺术
在早期版本 DpHF18 中，纤维的亚基以一种“反平行排列（D1 对称性）”方式堆叠，这会导致纤维内部出现“非设计的界面”，造成结构偏差。
研究团队发现这个问题后，通过对界面残基的精准改造——仅仅五个氨基酸替换，就让结构转变为他们原本设计的“平行螺旋（C1 对称性）”。
在 Fig. 2b 中，左侧是 DpHF18 的反平行结构，右侧是优化后的 DpHF19 的平行结构；方向箭头标出了两者完全不同的对称性。而 Fig. 2c 展示的，就是那几个至关重要的突变位点：两个突变（V29D 和 L82D）破坏了非目标界面，另外三个突变（E32D、E33K、E87K）强化了目标界面的氢键网络。
可以说，这一轮微调让整个体系从“能装”变成了“精准装”。
3. 一致性验证：原子级“重合”
在 Fig. 2d–e 中，研究者将 DpHF19 的 cryo-EM 结构（青色）与计算模型（灰色）叠合，
结果几乎无法分辨差异——这意味着模型中的每一圈旋转、每一个氨基酸朝向、每一个亚基的相对位移，
都与实验观测一致。
这不仅是一次设计成功，更是一次理论可预测性的证明：
“我们可以在计算机中精确地设计出一个会自组装、可响应的蛋白纳米结构。”
三、在 1 秒之间：蛋白丝的“呼吸”
当这些设计好的蛋白丝真正组装起来后，研究团队开始测试它们对 pH 的响应。
结果令人震撼——只要溶液的 pH 略微下降 0.3 个单位，丝就会瞬间解体；而当 pH 恢复，它们又能在几秒内重新组装成形。
就像自然界的丝蛋白在腺体里由液体变为固体，这些“人造丝”也在实验室中展现出同样的灵敏性与可逆性。
1. 分步降 pH：纤维的“呼吸周期”
研究者首先用负染电镜观察了三种设计：
DpHF18、DpHF19 和 DpHF19_9his（后者含 9 个埋藏组氨酸）。他们逐步调节溶液 pH（从 8 降到 6、5、4.2、3.5、3），然后再升回中性（pH 8），观察纤维长度的变化。
从 Fig. 3a 的箱线图中可以看到：
在中性条件（pH 8）下，纤维整齐而延展；
当 pH 降到临界点时，纤维长度骤减至零；
当 pH 再度升高，纤维又重新出现。
更令人印象深刻的是：
不同设计的解装 pH 点不同，
DpHF18 在 pH 3.5 解装；
DpHF19 在 pH 3.0 解装；
DpHF19_9his（9 个组氨酸）在 pH 4.2 解装。
这说明 通过调节组氨酸数量，就能精确“调节响应阈值”。
这在蛋白设计领域是一个极其重要的控制能力。
可以把这幅图理解成分子的“呼吸曲线”：
pH 降低——蛋白丝呼出一口气（解装）；pH 回升——它又吸气复位（重组）。
2. 分子显微镜下的“丝的生长”
接下来，团队用 全内反射荧光显微镜（TIRFM） 拍摄了纤维的组装过程。他们将红色荧光（Cy5）标记的“老纤维”与绿色荧光（Oregon488）标记的“新单体”混合，结果看到：绿色的荧光信号只在红色纤维的两端延伸，意味着这些蛋白丝的生长是从“末端”延伸的，就像细胞骨架微管那样有极性。
这说明这些人造丝不仅能组装，还能动态延伸与修复，具备天然蛋白聚合体系才有的方向性装配行为。
3. 毫秒级解装：一个真正的“分子开关”
团队在流动池中让溶液 pH 从 8 快速降低到 3，并实时拍摄 DpHF18–Cy5 纤维的变化。
结果几乎令人不敢相信：不到 1 秒钟，整根纤维就完全解体（见 Fig. 3d）。
在 Fig. 3e 的折线图中可以看到——当 pH 仅从 3.4 降到 3.1，纤维长度曲线瞬间坍塌；而在 3.4 时却依然稳定存在。
换句话说，这个体系对 pH 的响应锐度达到 0.3 个 pH 单位以内，
是一个真正意义上的“分子级数字开关（molecular digital switch）”。
4. 总结：分子层级的灵敏与可逆
这组实验揭示出几个极具启发性的结论：
设计的蛋白丝可在中性 pH 下稳定存在，在酸性下完全解装；
响应过程极快（<1 秒）且完全可逆；
增加埋藏组氨酸的数量，可精确调节开关的触发点；
自组装与解组过程都遵循高度协同性，体现出精细的能量调控。
四、在显微镜下“看见”分子的解体
前一节我们看到了这些蛋白丝能在宏观层面上实现可逆组装。
但 Baker 团队想更进一步——
“这一切到底是怎么发生的？
一根丝，在解体时，会从哪里开始崩解？
解装是瞬间碎裂，还是从端点一点点消融？”
为了回答这些问题，他们使用了液相原子力显微镜（AFM）——一种能够在溶液中实时观察纳米结构表面动态变化的技术。
1. pH 下降时的“融化电影”
在实验中，研究者将 DpHF19_9his（含 9 个组氨酸）的纤维轻轻铺在云母片上，然后缓缓将溶液 pH 从 8 降到 4.5、4.4、4.1。
接着，他们连续拍摄了每一分钟的形貌变化（如 Fig. 4a–c 所示）。
画面中，我们看到的场景是这样的：
在 pH 4.5 时，丝还纹理清晰、几乎不动；
当降到 pH 4.4，丝的末端开始轻微塌陷，局部变短；
再到 pH 4.1，整条丝快速“融化”消失，仿佛被酸轻轻“抹去”。
AFM 的高度曲线显示，丝的平均长度缩短速率在 pH 4.1 时达到 108 nm/min，而在 4.4 时仅为 21 nm/min。
短短 0.3 个 pH 单位的差异，就能带来五倍的速度变化。
这再次证明：这些丝的响应是高度协同、超灵敏的。
2. 解装机制：从两端开始的“分子消解”
进一步的单丝追踪分析表明：
大多数纤维在两端同时解体，长度对称地缩短；
但也有一些纤维因为一端吸附在表面上，只从另一端“融化”；
有时，纤维会先断裂成几个短段，再从各段两端继续分解。
这些现象说明，丝的解体并非单一模式，而是一种多机制协同过程。
每一根丝都像有“自己的命运”，但总体规律却非常一致。
3. 光控酸触发：用光“写图案”的分子艺术
Baker 团队在这一节做了一个非常酷的实验 ——
他们往溶液里加入一种叫 2-硝基苯甲醛（2-nitrobenzaldehyde） 的光酸分子（photoacid）。
当光酸被紫外光照射后，会释放质子，使局部 pH 降低。
于是他们有了一个大胆的设想：
“如果我们用光照局部区域，能不能只让那一块的丝解体，而其他区域保持完整？”
实验结果堪称艺术品。
如 Fig. 4e 所示：
当用 405 nm 激光点照时，纤维只在照射区域内消失，形成精确的“点”或“线”图案；
当用 364 nm 灯光全局照射时，整个样品表面的纤维都被同时“溶解”；
而未照光或光酸耗尽的对照组中，纤维完好无损。
研究者相当于实现了一个“光控分子橡皮擦”：
通过紫外光的照射，就能在纳米尺度上精准地擦除、重构这些蛋白丝的分布。
这是一个非常未来感的概念——
用光操控分子结构，实现空间可编程的纳米装配。
4. 意义总结：从“响应”到“可控响应”
这一系列实验揭示出三个关键科学突破：
时间分辨率：首次在液相中实时捕捉到蛋白丝逐步解体的全过程；
灵敏度极高：pH 仅改变 0.1–0.3 即可触发显著动力学变化；
外部可控性：通过光酸实现局部、可逆、空间精准的响应。
这意味着，Baker 团队设计的体系不仅会“响应环境”，还可以被“人类控制”。
从此，“蛋白质材料”的设计不再只是被动的结构模仿，而开始走向主动的分子编程（programmable molecular engineering）。
五、总结与展望
这项工作展示了 de novo 蛋白设计 在构建环境响应性材料方面的最新进展。
研究团队通过理性设计，实现了一个能够在极窄 pH 范围内可逆组装的螺旋蛋白丝体系，并在原子层级上验证了设计与实验的一致性。
该体系的几个关键特征值得强调：
结构精度高 —— cryo-EM 结构与设计模型几乎完全一致（界面 RMSD 仅 1.4 Å）；
响应极为灵敏 —— 仅 0.3 个 pH 单位的变化即可触发丝的快速解装（<1 s）；
可逆且可控 —— 通过改变组氨酸数量或引入光酸，可实现对响应点与空间分布的精确调控。
这些成果说明，蛋白设计已从“稳定结构的构建”迈向“动态功能的控制”。
通过结合计算设计与实验验证，研究者实现了对自组装蛋白体系响应行为的定量可编程化。
未来，这类体系有潜力应用于：
智能药物递送与可控释放，利用 pH 或光信号实现空间与时间选择性；
可逆水凝胶或生物复合材料，在组织工程与再生医学中提供环境敏感的结构支撑；
纳米级信号响应组件，作为合成生物系统或分子机器人中的动态模块。
总体来看，这篇工作为“可预测、可调控的蛋白自组装材料”提供了清晰的设计路线，也标志着计算蛋白设计正从结构可控进入功能可控的新阶段。
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