BindCraft：一站式设计功能性蛋白 Binder 的自动化平台
今天要介绍的这篇论文《BindCraft: one-shot design of functional protein binders》提出了一个自动化蛋白质结合剂设计平台——BindCraft，它通过反向优化 AlphaFold2 模型，无需高通量筛选即可快速设计出高亲和力的功能性结合蛋白。
在蛋白结合剂开发中，传统方法往往依赖昂贵的实验筛选和结构信息，效率低、门槛高。BindCraft 的出现，为缺乏结构基础和筛选平台的实验室提供了一种“开箱即用”的解决方案，极大降低了蛋白设计的技术门槛，在免疫调节、变应原阻断、CRISPR干预等多个领域展现出广泛应用潜力。
🧠 研究背景与目标
背景：
蛋白-蛋白相互作用（PPIs）在几乎所有生命过程（如免疫、信号转导）中都至关重要。
传统设计蛋白结合剂的方法（如抗体筛选、定向进化等）成本高、效率低。
深度学习模型（尤其是 AlphaFold2）的发展为结构预测与结合设计提供了强大工具。
目标：
开发一种高效、自动化的蛋白质设计平台 BindCraft；
利用 AlphaFold2 模型进行结构预测与反向优化，无需已知结合位点；
实现“设计一次即成功”（one-shot design），降低实验依赖；
推动蛋白质工程向广泛可及、按需定制的发展。
🧪 BindCraft 的核心原理与创新点
BindCraft 的设计流程如图所示，围绕 AlphaFold2（AF2）展开，形成一个从目标结构输入到功能结合剂输出的全自动闭环系统：
🔁 整体流程概览：
目标蛋白结构输入（Target protein）
用户提供蛋白三维结构（可从AlphaFold、PDB获取）；
可选定结合热点（Hotspot）或自动识别结合区域。
结合剂设计初始生成（AF2 multimer trajectory）
采用 AlphaFold2 Multimer 模型进行“幻觉式”设计（hallucination）；
结合剂的骨架结构与序列协同优化，同时预测其与目标蛋白的结合界面；
每一步预测都动态调整两者界面结构，提高适配性。
序列微调（solMPNN）
利用 solMPNN 优化非界面区域（即远离结合界面的位置），以提升蛋白的表达性、稳定性和可溶性；
保留关键结合区域不变，从而保持亲和力。
结构验证与筛选（AF2 monomer）
使用 AF2 单体模型重新预测优化后的设计结构；
筛选步骤结合 AlphaFold confidence score 与 Rosetta 打分机制，确保结构稳定且合理；
最终输出具有高亲和力和良好结构质量的结合剂候选。
🌟 关键创新点
反向传播式结构设计：通过 AlphaFold2 模型权重实现反向优化，无需大规模结构采样或数据库模板；
多步神经网络协同优化：将 AF2、MPNN、Rosetta 等模型有机集成，每步优化不同目标（结合位点、稳定性、全局折叠）；
非依赖已知位点：无需已知结合区域也能生成高亲和力结合剂，扩大适用范围；
一步到位式（One-shot）策略：不同于传统方法需筛选数千个设计，BindCraft 常仅需十几个设计即有成功结合结果；
普适且自动化：支持多种蛋白类型（如受体、变应原、核酸酶等），流程自动，适合非结构生物学背景的用户。
🔬 实验验证
作者通过设计并测试共九个蛋白靶点（共四类蛋白）目标，验证了 BindCraft 在多样场景下的有效性（见上图）：
- 细胞受体类（Cellular receptors）：如 PD-1、PD-L1、IFNAR2 和 CD45，设计结合剂展示出纳摩尔级亲和力，其中 PD-1 的最佳结合剂亲和力甚至低于 1 nM。
- 常见过敏原（Common allergens）：针对 DerF7、DerF21 和 BetV1 的设计表明，BindCraft 可用于阻断 IgE 结合位点，具有潜在治疗价值。
- 多结构域核酸酶（SpCas9）：6 个设计中全部验证成功，证明该方法可用于调控基因编辑工具。
- 新设计蛋白与复杂结构蛋白（De novo & Structural）：如 BBF-14 和 Sas6，也获得良好结合效果，显示该方法对未知或难靶蛋白也适用。
🧪 BindCraft设计流程简介（Design Protocol）
该流程是一个自动化的设计管线，分为如下关键步骤 ：
1. 输入配置
用户以 JSON 格式提供目标蛋白（PDB格式）、binder长度范围、目标设计数量等；
可指定结合热点（residue/chains）或不指定，由系统自动选点。
2. AF2幻觉设计（Hallucination）
利用 ColabDesign 实现的 AlphaFold2 Multimer 进行 binder 序列与结构生成；
初始化为随机序列，通过反向传播和误差梯度（L×20）优化每个残基；
使用五种 AF2 模型轮换，提高鲁棒性、避免过拟合。
3. 设计损失函数（Design Loss）
综合多个结构与界面质量指标，常用的权重包括：
结构可信度（Binder confidence pLDDT, weight 0.1）
相互作用界面可信度（interface confidence i_pTM, weight 0.05）
对齐误差 (Normalized prediceted alignment error pAE）等（binder 内部误差: weight 0.4，binder-target间误差, weight 0.1）
接触损失（Reisude contact loss , weight 1.0）
螺旋化倾向（helicity loss, weight -0.3）鼓励非螺旋结构
结合点收缩（终端靠近, weight 0.1）
4. 序列优化阶段（4个阶段）
序列优化阶段是 BindCraft 设计流程的关键环节之一，目标是在已初步拟合目标蛋白的结合剂结构基础上，进一步优化其序列，以提高亲和力、结构稳定性以及生物可表达性。主要通过以下四个阶段来实现：
阶段一：连续序列空间优化
目标：探索多样性的序列-结构空间，尤其是在结合界面。
方法：
序列以 logits（连续值）表示，每个位置允许多个氨基酸选择；
每一步的序列计算为：
$$
\text{Sequence} = (1 - \lambda) \cdot \text{logits} + \lambda \cdot \text{softmax}(\text{logits} / T)$$
其中：
$$
\lambda = \frac{\text{step} + 1}{\text{iterations}}$$
$$
T = 1.0$$，为恒定温度
通过迭代，动态地将优化从logits逐步引导至概率分布。
特殊处理：
若 AlphaFold2 confidence 分数（pLDDT）低，提前终止该设计轨迹；
若检测到 β-sheet 构象，增加 AF2循环次数从1到3，提高结构预测精度
迭代轮次：
初始50步用于粗略收敛；
若表现良好，再进行25步延伸优化。
阶段二：softmax 收敛收束
目标：从概率表示过渡到更可信、收敛的氨基酸选择。
方法：
logits → softmax，得到明确的概率分布；
温度 T 随迭代逐步降低，引导从探索向收敛过渡
$$
T = 10^{-2} + (1 - 10^{-2}) \cdot \left(1 - \frac{\text{step} + 1}{\text{iterations}}\right)^2$$
- 学习率也随温度同步衰减，确保收敛稳定。
阶段三：Straight-through Estimator
目标：从概率向离散表示过渡，同时保持可反向传播。
方法：
序列以 one-hot 形式呈现给模型（即每个位点为单个氨基酸）；
但反向传播依然通过 softmax 进行（称为“Straight-through”）；
实现“看起来是离散的、训练时是连续的”效果。
阶段四：离散微调
目标：最终固定具体氨基酸序列，确保最佳的结构质量和接口表现。
方法：
使用 softmax 概率分布对每个位点进行 随机采样突变；
每次采样$$ X = 0.05 \times \text{binder length} $$个残基，保留最优损失组合；
类似于 局部搜索 + 贪婪优化。
✅ 最终筛选标准
pLDDT < 0.7 → 排除；
界面接触点 < 7 → 排除；
骨架严重冲突或异常扭曲结构 → 排除。
5. 后处理优化 （solMPNN + AF2 + Rosetta)
这一阶段的目的是对初步设计的结合剂进行结构精炼和功能验证，最终确保它们不仅“结合得上”，还具备良好的稳定性、表达性和能量学合理性。这是 BindCraft 区别于许多简单AI生成方法的重要一环。
🌟 1. MPNNsol 优化：提高结合剂稳定性与溶解性
适用于：已通过结构筛选的“成功设计轨迹”；
工具：使用 ProteinMPNN 的溶剂权重版本（MPNNsol）；
优化策略：
保留结合界面附近4 Å以内的残基，避免破坏亲和力；
对其余 核心和表面残基重新设计，每个轨迹生成 20 个新序列；
温度设为 0.1（控制采样多样性），不引入骨架噪声（backbone noise = 0.0）
🔁 2. 结构验证：AF2单体模式再预测
使用 AlphaFold2 monomer 模型对新序列进行重构预测；
参数设置：
循环（recycle）次数为3次，提高预测精度；
使用 2个基于模板的模型，但以“单序列模式”运行，防止多序列比对偏差；
目的：验证MPNNsol优化后的序列是否保持结构可靠性。
⚙️ 3. 能量最小化与界面评估：Rosetta分析
使用 Rosetta 的 FastRelax 模块对 AF2 预测结构进行全原子能量最小化（200次迭代）；
再通过 InterfaceAnalyzer 模块分析蛋白-蛋白界面质量，计算包括：
界面能量（binding energy）；
接触面积；
副链/主链结构调整对结合效果的贡献；
6. 筛选标准总结：确保设计质量的过滤条件
在 BindCraft 流程的最后阶段，所有设计将通过一系列预设过滤条件进行筛选，以确保仅保留结构可信、功能合理、具实验潜力的高质量binder。
这些标准基于既往文献经验并在本研究中进一步优化，具体包括：
AF2整体结构可信度（pLDDT）：> 0.8
AF2结合界面可信度（i_pTM）：> 0.5
AF2界面对齐误差（i_pAE）：> 0.35（值越高表示对齐误差越小）
Rosetta界面形状互补性（Shape Complementarity）：> 0.55
未饱和氢键数（unsatisfied H-bonds）：< 3
结合剂表面疏水性：< 35%
结合态与游离态的RMSD差异：< 3.5 Å
这些标准共同确保输出binder结构稳定、界面紧密、可溶性良好、预测结果可信，适合进入实验验证阶段。
🧾 总结与讨论
🔬 1. 背景与意义
蛋白-蛋白相互作用（PPIs）的计算设计长期是蛋白质工程的核心挑战；
难点在于：我们对分子识别机制（特别是结合位点的物理化学特征）仍了解有限；
借助 AlphaFold2 等深度学习结构预测工具，现已能对新设计的结合剂进行更准确评估。
⚙️ 2. BindCraft 的独特优势
基于 AF2 网络的反向传播优化，首次实现结合剂“幻觉式”设计；
相比于多数固定靶点的方法，BindCraft 允许目标蛋白本身存在柔性，有助于捕捉结合诱导的构象变化；
系统可自动识别高结合倾向位点，无需事先定义目标区域。
📈 3. 实验表现与成功率
在12种复杂目标蛋白上设计结合剂，亲和力大多达到纳摩尔水平，极少数为微摩尔；
平均成功率为 46.3%，显著高于传统方法（如 RFdiffusion、AlphaProteo）；
在社区挑战中设计的结合剂还获得第一名，成功靶向 EGFR 高难度靶点。
🔍 4. 面对的挑战与扩展前景
PPI设计的主要挑战在于选择合适的结合表位，尤其是疏水且结构平坦的区域；
BindCraft 能处理既有已知结合位点的蛋白，也能在 de novo、变应原或核酸酶等复杂系统中自动定位结合区域；
在设计结合 蛋白-核酸界面结合剂方面也展现出潜力，为未来开发转录因子抑制剂等功能工具提供新方向。
🧪 5. 局限性与潜在问题
参数需个性化调整
默认设置（迭代次数、损失权重、筛选阈值）可能不适用于所有目标蛋白；
对于不同靶标，可能需要根据经验调整这些参数以获得理想结果。
结合位点选择仍关键
尽管 AlphaFold2 在自动识别结合位点方面表现优秀，指定热点位点仍能提升设计成功率；
自动识别虽然有效，但在特定生物功能需求下，人工选择更具可控性。
亲水界面预测较弱
- 相比疏水界面，AF2 在亲水性结合界面的预测与设计效果更差，需谨慎解读结果。
结构变形常见但可控
在设计过程中，某些结合剂轨迹可能出现结构变形或“被压扁”（squashed）；
这是 AF2 Multimer 对输入序列高度敏感所致，属正常现象；
此类无效轨迹会被系统自动识别并快速剔除，不影响整体流程稳定性。
因此，使用 BindCraft 时要注意：虽然系统自动化程度高，但仍需人为判断与适配，特别是在新靶点上使用时。
📚 原文与资源信息
论文标题：BindCraft: one-shot design of functional protein binders
发表平台：bioRxiv（预印本）
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.09.30.615802v3
代码仓库（GitHub）：
BindCraft 官方开源代码与使用说明已公开，支持用户在本地运行完整设计流程：
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