AI for Proteins: 工具那么多，我究竟该用哪个？蓝极的完整清单

蓝极说： xxxx 办这个公众号以来，我一直在跟大家介绍AI for proteins领域新的工具。但慢慢，我在评论区和私信发现很多朋友都在问：

“针对我自己的课题，到底该用哪些工具？”

现在我们生活在一个快速发展的时代，工具日新月异，隔三差五就有一个新模型，让人眼花缭乱。

但“多”，并不一定是好事。古诗中有“乱花渐欲迷人眼”，工具多起来之后，我们反而在遇到一个具体的问题的时候，并不清楚该怎么选、怎么搭、甚至不知道从哪一步开始。

最近我读到了Tamrind Bio写的一篇工具清单文章，基于这篇文章，我把过去几年AI for proteins领域已经成熟、可用并被反复验证的方法，系统性的总结成了这篇文章。

所以这篇文章适合正在真正动手做蛋白设计的人：

不论你是在做抗体、酶、多肽，还是刚刚开始尝试把 AI 方法引入自己的课题，希望知道每一步常用什么工具、这些工具大概解决什么问题。

但如果你期待的是某一个万能模型，或者只想找一个按钮按下去就出结果的方案，这篇文章可能并不适合你；它更像一份工作台旁边的参考清单，帮你在不同阶段做出更合理的选择。

希望能够帮助到有志于进行计算蛋白设计的各位！我们一起努力，从“乱花渐欲迷人眼”一步一步变成“拨得云开见月明”！

原文链接：https://www.tamarind.bio/blog/a-comprehensive-introduction-to-ai-for-proteins

1. Approaches & Solutions（Deep Learning）

1.1 结构预测与对接（Structure Prediction & Docking）

在过去几年里，深度学习方法在蛋白质结构预测领域取得了最明确、也是最具决定性的进展。这一轮进展的起点，几乎可以明确追溯到 AlphaFold2。

AlphaFold2 在 CASP 结构预测竞赛中，几乎全面超越了此前的所有方法——无论是单链蛋白，还是蛋白复合物。这一结果不仅刷新了预测精度的上限，也直接推动了大量结构相关工作的落地，使“基于结构的研究”在更多场景中变得可行。

在 AlphaFold2 之后，DeepMind 又发布了 AlphaFold3。不过，AlphaFold3 目前不允许商业用途。因此，学术界和工业界的许多团队，选择基于公开论文内容，开发并发布了不同程度的复现版本。这些方法在整体性能上相近，但在具体设计目标和适用场景上，各有侧重。

1.1.1 结构预测工具的一些差异化方向

尽管多数 AlphaFold2 复现方法在基础预测能力上相似，但一些工具在特定任务上做了有针对性的改进：

  • Chai-1

    • 引入了约束（restraints）机制，用于明确描述蛋白之间的结合位点。这一设计在对接任务中显著提升了预测精度，在免疫球蛋白（Ig）相关问题中尤其有价值。

  • Boltz-2 / Boltz-1x

    • 针对蛋白–小分子复合物的物理准确性进行了专门优化，更适合用于酶或小分子靶向蛋白的场景。同时，这些模型还可以用于预测蛋白与小分子之间的结合亲和力。

  • AlphaRED

    • 将预测得到的结构与基于 Rosetta 的物理建模方法相结合，用于进一步提升对接构象的质量。

在实际应用中，针对特定任务或模态优化的结构预测工具，往往在各自的细分领域中更快、或更准确。例如，PLACER、AbodyBuilder、TCRModel2 等工具，专门针对特定蛋白类型或结构问题进行了定制化设计，后文将分别介绍。

1.1.2 结构预测的不止是“结构”

除了为给定序列生成三维结构外，AlphaFold 及其相关模型通常还会输出多种置信度指标。这些指标在实践中被广泛用于评估预测结果的可靠性，并在一定程度上反映序列折叠的稳定性与可行性。

在很多工作流程中，这类置信度信息已经成为筛选候选序列、判断设计是否值得进入实验阶段的重要参考。

1.2 从头设计（De novo design）

与结构预测相比，从头设计蛋白质面对的是一类本质上不同的问题。

在这一类任务中，输入通常并不是一条已有的蛋白序列，而是一个相对抽象的目标——例如一个已知结构的蛋白，或一个小分子配体。设计的目标，是生成一条全新的蛋白序列，使其能够以预期的方式与目标分子结合，或形成所需的结构特征。

需要注意的是，尽管被称为“从头设计”，大多数设计流程仍然依赖目标分子的结构信息。换句话说，这些方法并不是在没有任何几何约束的情况下自由生成序列，而是在明确的结构背景下进行受限搜索。

1.2.1 迷你蛋白结合体（Miniprotein binders）

在当前的从头设计范式中，迷你蛋白结合体是一类表现尤为突出的分子类型。这类蛋白通常长度在 50–200 个氨基酸之间，在设计空间可控性和实验成功率之间取得了较好的平衡。

在实践中，如果一个设计方案能够通过诸如 BindCraft 等工具设定的计算筛选标准，那么在单轮表达实验中，往往可以从 10–20 个候选中获得 10–100% 的命中率，其中中位数解离常数（KD）通常落在 1–30 nM 的范围内。

此外，一些组合流程也正在受到关注，例如将 RFdiffusion、MPNN 和 AlphaFold 串联使用的设计流程。这类流程在多个目标上显示出稳定的表现，值得持续跟踪。

1.2.2 抗体（Antibodies）

与迷你蛋白相比，抗体的从头设计仍然处于相对早期阶段，整体成熟度较低。

尽管如此，近年来这一方向已经出现了实质性进展。对于多种不同靶标，一些工具已经能够稳定地产生 10–20% 的命中率。这些方法包括 Boltzgen、Germinal、RFantibody、mBER 等。

总体而言，抗体从头设计已经不再是极低概率事件，但在亲和力、可开发性以及稳定性等方面，仍然常常需要后续的优化步骤。

1.2.3 肽（Peptides）

在肽类分子的设计中，基于结构的方法同样取得了显著进展。

针对线性肽和环肽，多个工具已经展示出较高的即时命中率，包括 Boltzgen、BindCraft、PXDesign、RFpeptides 等。

这些方法在多个体系中验证了其可行性，使得肽类分子的从头设计在实践中变得更加可靠，也更容易与实验流程结合。

1.3 通过反向折叠进行优化（Optimization with Inverse Folding）

反向折叠（Inverse Folding）可以被理解为结构预测问题的“反面”。

在结构预测中，输入是一条序列，目标是预测其三维结构；而在反向折叠中，输入的是一个给定的蛋白结构，目标则是生成一条新的序列，使其仍然能够折叠成该结构。

需要强调的是，这里的“结构”并不一定来自实验解析，也可以是由结构预测模型生成的结构。因此，反向折叠往往作为结构预测或从头设计流程中的一个下游步骤，用于进一步优化序列质量。

1.3.1 ProteinMPNN

ProteinMPNN 是目前应用最广泛的反向折叠工具之一。

在使用 ProteinMPNN 时，研究者通常会指定结构中的一组位置索引，模型会在保持整体骨架不变的前提下，为这些位置重新分配更合适的氨基酸残基。生成的序列在结构一致性上受到严格约束。

由于模型的训练数据主要来自已解析结构，ProteinMPNN 生成的序列往往在可溶性、稳定性以及表达表现上具有较好的性质。这使得它在设计流程中被广泛用于“清洗”或“打磨”初始设计结果。

1.3.2 SolubleMPNN

SolubleMPNN 是 ProteinMPNN 的一个专门化版本，训练时聚焦于可溶性蛋白。

这一模型在 GPCR 可溶化以及一般蛋白适配性优化方面，展示了有趣的结果。在一些案例中，通过对原本膜结合或不稳定的蛋白结构进行反向折叠优化，可以获得在实验中表现更佳的可溶性变体。

1.3.3 抗体相关应用

在抗体设计中，逆向折叠方法同样被广泛使用。

AntiFold 和 IgDesign 是基于 ProteinMPNN 思路发展的专用工具，主要针对抗体–抗原复合物结构，对互补决定区（CDRs）进行替换，以提升结合亲和力。

在实践中，这类方法通常可以产生比原始抗体更优的结合体，但仍然需要对数量在百级左右的候选进行实验验证，才能筛选出表现稳定的结果。

一个常见的应用策略是：

在计算层面生成非常大量的候选序列（例如数十万到上百万条），再从中筛选出评分最高的一小部分（通常约 100 条）进入湿实验验证阶段。

1.4 主动学习（Active Learning）

随着模型能力的提升，越来越多的设计流程开始将 实验数据直接纳入迭代过程。这一类方法通常被称为“主动学习”或“lab-in-the-loop”设计。

其核心思想并不复杂：

模型不再一次性给出大量设计结果，而是通过多轮“小规模实验 + 模型更新”的方式，逐步逼近更优的序列空间。

1.4.1 Lab-in-the-loop的抗体设计

Genentech 与 Prescient Design 提出了一种将湿实验数据持续反馈到模型中的抗体设计流程。

在这一工作中，研究者以动物免疫或库挖掘得到的初始抗体为起点，围绕多个靶标（包括 EGFR、IL-6、HER2、OSM 等），在四轮设计与实验循环中，总共测试了约 1,800 个变体。

每一轮中，模型都会结合新获得的实验数据，重新训练或更新生成策略，并在下一轮中提出新的设计候选。

在性能上，这一流程在所有靶标上都实现了 3–100 倍的亲和力提升；其中多个先导分子在仅四轮设计后就达到了约 100 pM 的解离常数（KD），已处于可治疗分子的范围内。

在具体实现上，NOS/LaMBO-2 与 DyAb 等生成模型被用于序列提出，而多种可开发性预测器则在每一轮中用于辅助筛选。这些模型均基于不断积累的实验数据进行训练。

1.4.2 主动学习辅助的定向进化（ALDE）

主动学习同样可以与传统的定向进化（Directed Evolution）结合使用，形成 Active Learning-assisted Directed Evolution（ALDE）。

在这一框架中，不确定性可感知的机器学习模型被用于指导突变选择，从而在存在显著上位性（epistasis）的序列空间中，更高效地定位高性能区域。

在一个示例中，研究者通过三轮迭代，对一个环丙烷酶的五个活性位点残基进行优化，将产物得率从 12% 提升至 93%。在多个公开数据集上的模拟结果也显示，ALDE 方法在效率上持续优于传统的定向进化策略。

1.4.3 EVOLVEpro

EVOLVEpro 是另一种以数据稀疏为设计前提的主动学习方法。

该方法在每一轮中仅需要约 10 次实验测量，即可建立序列到功能的映射，并用于多目标优化。在多项基准测试以及六个不同的实验体系中（包括抗体、CRISPR 核酸酶、prime editor、丝氨酸整合酶和 T7 RNA 聚合酶等），EVOLVEpro 实现了 40 到 100 倍的性能提升。

与零样本的蛋白语言模型预测和传统定向进化方法相比，该结果显示，在实验数据受限的条件下，由语言模型引导的迭代设计已经成为更具竞争力的策略。

2. 抗体（Antibodies）

2.1 Affinity Maturation（亲和力成熟）

在抗体相关应用中，AI 方法最成熟、也最接近实际使用的一类任务，是亲和力成熟。

这一问题的出发点通常并不是“从零设计”一条抗体序列，而是已经拥有一个能够结合靶标的抗体。设计目标，是在尽量保持原有结构与可开发性的前提下，通过有限的序列修改，提高其结合亲和力。

在这一背景下，反向折叠（Inverse Folding） 成为常用手段。

2.1.1 基于反向折叠的亲和力优化

如前文所述，反向折叠的核心思想是：

在固定蛋白整体结构的前提下，为选定位置重新分配氨基酸残基，使生成的序列更“适合”该结构。

在抗体设计中，这一策略通常应用于抗体–抗原复合物结构，重点针对互补决定区（CDRs）进行优化。

AntiFold 和 IgDesign 是这一方向中较为典型的工具。

它们以抗体–抗原复合物结构作为输入，在保持整体构象不变的情况下，对 CDR 区域进行替换，从而提升结合能力。

在实际应用中，这类方法往往能够生成比原始抗体更优的结合体。但与此同时，它们仍然需要较大规模的实验验证——通常需要对约百条候选序列进行筛选，才能稳定获得表现理想的结果。

2.1.2 计算规模与实验筛选的配合

一个常见的实践策略是：

在计算阶段生成非常大量的候选序列（例如数十万到上百万条），再基于评分函数筛选出排名靠前的一小部分（通常在 100 条左右），用于湿实验验证。

这种“宽生成、严筛选”的流程，使得反向折叠方法在抗体亲和力成熟中具备较高的实用性，也较容易与现有的实验体系对接。

2.2 Language Models（语言模型）

除了基于结构的反向折叠方法，序列语言模型也是抗体设计中常用的一类工具。

这类模型直接以氨基酸序列为输入，通过“掩码（masking）”的方式，对任意位置的残基进行替换或补全。常见的模型包括 ESM、ProTrek、AntiBERTy 和 AbLang 等。

2.2.1 语言模型的特点与倾向

由于语言模型的训练数据主要来自自然界中真实存在的蛋白序列，它们在提出突变建议时，往往倾向于生成更接近胚系（germline）的序列。

这种特性在一定程度上有助于保持序列的天然性和可开发性，但也可能限制对亲和力的激进优化。

2.2.2 Efficient Evolution

Efficient Evolution 是一种利用语言模型直接提出点突变建议的方法，其目标是提高抗体与靶标之间的结合亲和力。

在相关研究中，作者对 7 个抗体体系进行了测试，在两轮设计中，每个抗体仅评估不超过 20 个设计序列。结果显示：

  • 对于 4 个已成熟抗体，亲和力最高可提升约 7 倍

  • 对于 3 个未成熟抗体，亲和力最高可提升至原来的 160 倍

尽管该方法主要在抗体体系中进行了验证，但其思路在理论上也可推广至其他蛋白类型。

2.2.3 反向折叠与语言模型的结合

近期一个值得注意的进展，是将反向折叠方法与语言模型进行组合使用。

在这一策略中，语言模型与 ProteinMPNN 等反向折叠工具协同工作，用于生成整体适配性更高的序列。二者在设计偏好上具有一定互补性：

语言模型倾向于将序列“拉回”胚系，而反向折叠方法则更保守地维持原有结构特征。

在一个示例中，研究者使用该组合方法重新设计了 trastuzumab 的 CDRH3 环区，对 96 个变体进行了实验测试。结果显示，其中有 36 个变体能够结合 HER2，而仅使用 ProteinMPNN 时，在同样数量的设计中仅获得 3 个有效结合体。

2.2.4 主动学习

在抗体设计中，语言模型同样可以与主动学习流程结合使用。这一部分的具体方法与前文介绍的主动学习框架一致，此处不再展开。

2.3 Structure Prediction（结构预测）

在抗体相关应用中，结构预测仍然是多种设计流程的基础环节，尤其是在抗体–抗原复合物建模中。

目前，AlphaFold2、Chai、Boltz 以及 OpenFold3 仍然是抗体–抗原（Ab–Ag）复合物结构预测的主流工具。在这些方法中，结构预测结果常被作为后续亲和力优化、反向折叠或对接分析的起点。

截至本文撰写时，AlphaFold3 结合 Rosetta 的物理建模流程，被认为是抗体–抗原对接质量最高的方案之一，尤其适用于对构象精度要求较高的应用场景。

2.3.1 ImmuneBuilder 工具集

针对免疫相关蛋白，牛津大学 Deane 实验室开发了一系列专用结构预测工具，并整合为 ImmuneBuilder 工具集。

该工具集覆盖了多种免疫蛋白类型，为抗体与相关受体的结构建模提供了标准化方案。

2.3.2 抗体与受体的专用结构预测工具

在更细分的任务中，一些专用工具在速度和准确性上具备明显优势：

  • AbodyBuilder2

    • 用于预测抗体 VH–VL 链在未与抗原结合状态下的结构，常作为抗体初始构象建模工具。

  • NanobodyBuilder

    • 专门针对 VHH（纳米抗体）的单链结构预测。

  • TCRModel2

    • 用于 T 细胞受体（TCR）的结构预测，适用于 TCR 相关免疫研究。

这些工具通过针对特定蛋白类型进行优化，在对应任务中通常比通用结构预测模型更加高效。

2.4 De novo design（从头设计）

近年来，抗体的从头设计工具数量迅速增加，其成功率也出现了明显跃升。

在早期，这类方法往往需要测试成千上万甚至上万条设计序列，才能获得极少数有效结合体；而在近期的工作中，命中率已经从“万分之一”提升到了两位数百分比，使得抗体从头设计逐步具备了实验可行性。

2.4.1 通用抗体设计框架

BoltzGen 是一类通用的生成式设计工具，能够设计蛋白、肽、纳米抗体等多种分子类型，使其与目标蛋白或小分子结合。

在抗体和纳米抗体设计中，BoltzGen 在多个全新靶标上取得了 60–70% 的成功率，且每个靶标仅需测试约 15 个设计序列。这一结果表明，在特定条件下，从头设计已经可以达到较高的实验效率。

2.4.2 专为抗体格式优化的模型

mBER 是一个开源的抗体设计框架，专门针对抗体格式的结合体设计进行了工程化优化。

该方法基于 ColabDesign 框架，通过结构模板和序列条件化设计，并允许在 AlphaFold-Multimer 中进行反向传播，从而生成高亲和力的 VHH（纳米抗体）结合体。

Germinal 则是另一种以抗体为核心设计对象的生成框架。与通用蛋白设计工具不同，Germinal 专门针对抗体格式进行优化，在指定框架上生成新的互补决定区（CDRs），同时尽量保留有利的可开发性特征。

2.4.3 RFantibody 及相关工作

RFantibody 展示了多个经实验验证的抗体设计实例，包括针对流感病毒的 VHH，以及针对 TcdB 和 Phox2b 肽–MHC 复合物的 scFv 设计。

这些结果表明，针对特定表位进行抗体从头设计在技术上已经可行，但在多数情况下，初始设计仍需要进一步的亲和力优化，才能满足应用需求。

2.4.4 工业界的专有平台

除学术界工具外，一些工业团队也发布了相关成果。

例如，Nabla Bio 的 JAM 平台，以及 Chai Discovery 的 Chai-2，均展示了利用专有平台进行抗体从头设计的实验结果。不过，这些方法的具体细节尚未公开。

2.5 Developability & Scoring（可开发性与打分）

在抗体设计中，即便一个分子在亲和力上表现良好，也未必适合进入真实的药物开发流程。因此，可开发性（developability）评估是抗体设计中不可或缺的一环。

近年来，越来越多的评估方法开始将物理特征与机器学习模型结合，对抗体的可开发性进行定量预测。

2.5.1 机器学习驱动的可开发性评估

新一代可开发性预测工具，通常会从抗体结构或序列中提取多种理化特征，并将这些特征作为输入，交由机器学习模型进行综合评估。

这些模型的目标，是在早期设计阶段识别潜在风险，从而减少后续实验和工艺开发中的不确定性。

2.5.2 TAP：常用的抗体可开发性评估框架

Therapeutic Antibody Profiler（TAP） 是目前较为常用的一种评估方法。

TAP 的基本思路是：

从抗体的模型结构中提取一系列基于物理的特征，例如疏水区域分布等，并将这些特征与临床阶段抗体的统计分布进行比较。

TAP 通常关注五类核心属性。如果其中任意一项明显偏离临床抗体的范围，往往意味着该抗体在可开发性方面存在潜在风险。

2.5.3 免疫原性预测

除了理化性质，免疫原性也是抗体开发中的关键考量因素。

工具如 DeepImmuno 和 TLimmuno，可以对任意肽段与 HLA 组合的免疫原性进行预测。这类方法常用于评估抗体序列中是否存在可能引发免疫反应的片段。

2.5.4 表面理化特征分析

对抗体表面性质的分析，常被用于指导具体的突变设计，以降低聚集倾向、改善黏度等问题。

例如，通过分析疏水或带电表面patch，可以定位需要优化的区域。

Masif 等工具利用表面嵌入表示，对蛋白表面特征进行系统化建模，为此类分析提供了新的手段。

2.5.5 其他性质预测工具

在具体应用中，研究者还会结合多种单项预测工具，对抗体的不同性质进行评估，包括：

这些工具通常作为辅助指标，与整体可开发性评估流程结合使用。

2.6 Humanization（人源化）

在抗体进入临床应用之前，人源化通常是必不可少的一步。

非人源抗体（例如来源于小鼠或其他物种）如果直接用于人体，往往会引发免疫反应，降低疗效甚至带来安全风险。因此，人源化的目标是在尽量保留原有结合能力的同时，使抗体序列在统计和结构层面更接近人类抗体。

2.6.1 基于统计与比对的方法

BioPhi 是一类结合统计分析与计算方法的人源化工具。

该方法通过将非人源抗体序列与大规模人类抗体数据库进行比对，识别序列中偏离“人类常见模式”的区域，并预测哪些位置适合进行替换，以提高整体的人源化程度，同时尽量维持原有的结合特性。

2.6.2 基于深度学习的人源化模型

Sapiens 代表了另一类思路，即利用深度学习模型直接学习人类抗体序列的统计特征。

这类模型通常基于大量人源抗体数据进行训练，能够在保持结构与功能完整性的前提下，预测更适合的人源化突变方案。相比规则或比对驱动的方法，深度学习模型在处理复杂依赖关系时具有更大的灵活性。

2.6.3 人源化在设计流程中的位置

在实际应用中，人源化通常并不是设计流程的起点，而是发生在亲和力优化和可开发性评估之后。

通过将人源化工具与前述的结构预测、反向折叠和可开发性评分方法结合，可以在尽量减少性能损失的前提下，将抗体推进到更接近临床应用的状态

3. Enzymes

3.1 Structure Prediction & Docking（结构预测与对接）

在酶设计与优化中，结构预测与配体对接承担着与抗体设计中类似、但更为苛刻的角色。

与单纯的结合问题不同，酶的功能高度依赖于活性位点的几何预组织（pre-organization）。微小的构象偏差，往往就足以显著影响催化效率。因此，对蛋白–底物复合物构象的准确建模，是酶设计流程中的关键环节。

3.1.1 PLACER（原 ChemNet）

PLACER 是一类专门面向蛋白–小分子复合物的结构建模工具。

该方法利用神经网络，从部分受扰或不完整的 CSD / PDB 结构中，重建小分子的构象以及蛋白侧链，并以随机采样的方式生成能够反映构象异质性的结构集合。这种设计使其能够快速捕捉蛋白–配体体系中可能存在的多种合理构象。

在酶设计中，PLACER 被用于评估活性位点的预组织程度。相关研究表明，将 PLACER 引入设计流程后，整体成功率显著提升，并成功获得了一个逆醛缩酶，其催化效率（kcat/KM）达到 1.1 × 10⁴ M⁻¹·min⁻¹，明显优于深度学习方法出现之前的设计结果。

在实践中，PLACER 常与主链结构预测工具（如 AlphaFold）结合使用，作为对接与催化优化流程中的一个高效升级模块。

3.1.2 Boltz-2

在蛋白–配体或蛋白–底物复合物结构预测方面，Boltz-2 是当前较为推荐的通用工具之一。

截止到目前（2026年1月5日），Boltz-2 在多种酶相关体系中表现出较好的稳定性，既可用于复合物构象预测，也可用于估计小分子与蛋白之间的结合亲和力。

需要注意的是，亲和力预测的可靠性在很大程度上依赖于对接构象本身的质量。因此，这类预测通常与高质量的结构建模流程配合使用。

3.1.3 Optimization（优化）

在完成初步的结构预测与对接之后，酶设计流程通常会进入针对性的优化阶段。

这一阶段的目标，不仅是提升结合稳定性，更重要的是优化与催化直接相关的几何关系，包括底物定位、关键残基排布以及活性位点环境。

通用优化方法：反向折叠

反向折叠（Inverse Folding） 是酶设计中常用的一类通用优化策略。

在固定蛋白主链结构的前提下，工具如 ProteinMPNN 和 SolubleMPNN 会对指定位置重新分配氨基酸残基，从而生成在稳定性、可溶性或表达表现上更优的序列。这类方法通常作为设计流程中的基础优化步骤。

基于结构的生成式优化

除了反向折叠，基于结构的生成式模型在酶优化中也逐渐发挥作用。

  • RFdiffusion 是一类基于扩散模型的方法，可用于围绕目标构象生成新的蛋白骨架、为结合口袋设计支撑结构，或对已有结合体的局部区域进行扩散式重构。

  • RFdiffusion All-atom 将这一思路扩展到原子分辨率，使其更适合涉及催化几何约束的应用场景。

  • Boltzdesign1 则采用“反向使用” Boltz 模型的思路，用于设计能够结合蛋白、小分子或 DNA / RNA 靶标的全新结合体，在酶相关任务中提供了另一种结构驱动的生成路径。

  • RFdiffusion3：目前最强的酶设计模型。

稳定性优化

稳定性仍然是酶设计中的重要考量因素。

ThermoMPNN 可对所有可能的点突变进行打分，预测其对蛋白稳定性的影响（ΔΔG），在多个基准测试中表现出良好的定量一致性。

FireProt 结合进化信息与物理建模，用于进一步筛选和组合有利突变，常作为稳定性优化流程中的补充工具。

3.2 De novo design（从头设计）

在酶这一类蛋白中，从头设计长期被认为是计算蛋白设计中最困难的任务之一。

原因在于，酶不仅需要与底物结合，还必须在多个反应状态下维持高度精确的几何关系。仅仅“能结合”并不足以产生催化活性，活性位点的预组织、过渡态稳定以及反应路径上的多态构象，都会直接影响最终的催化效率。

3.2.1 丝氨酸水解酶（Serine hydrolases）

近期的工作表明，结合扩散模型与多状态建模，可以显著提升从头设计酶的成功率。

在针对丝氨酸水解酶的研究中，研究者首先完全指定催化活性位点，包括丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的经典催化三联体，以及必要的氧阴离子孔（oxyanion hole）。随后，使用 RFdiffusion 在这些已知催化几何约束的基础上，生成支撑活性位点的蛋白主链骨架。

在获得主链结构后，研究者利用 LigandMPNN 为设计的骨架分配序列，并使用 PLACER 对反应路径中的多个催化状态进行逐一评估。这一流程确保了设计不仅在静态结构上合理，也在反应过程的关键状态中保持正确的几何关系。

3.2.2 催化几何对功能的决定性作用

实验结果显示，通过这一流程获得的设计酶，其晶体结构与计算模型高度一致，Cα RMSD 通常不超过 1 Å，并展现出最高可达 2.2 × 10⁵ M⁻¹·s⁻¹ 的催化效率，且在设计过程中未使用任何定向进化步骤。

研究进一步表明，简化的 Ser–His 二联体虽然可以产生反应性丝氨酸，但并不足以支持有效的催化循环；只有在完整的 Ser–His–Asp 三联体和氧阴离子孔同时存在的情况下，酶才能实现真正的催化周转。这一结果强调了催化几何在酶设计中的核心地位。

3.2.3 方法层面的意义

整体来看，基于扩散模型的骨架生成，以及对多反应状态进行显式建模的策略，在酶从头设计中展现出比以往计算方法更高的准确性和成功率。

这些结果表明，通过直接将催化几何与多状态预组织作为设计目标，而不是事后筛选条件，可以显著提升从头设计多步反应酶的可行性。

4. Peptides（多肽）

4.1 Property Prediction（性质预测）

在多肽设计中，性质预测通常是设计流程中的基础环节，用于评估候选序列在理化性质和可用性上的表现。

PepFuNN 是 Novo Nordisk 开发的一套多肽分析与设计工具，覆盖了多肽相关的多种性质评估任务，常被用于系统性分析和设计辅助。

CAMP 也是一类用于多肽性质分析的工具，但目前不支持商业用途，更多用于研究和方法探索。

4.2 De novo design（从头设计）

与其他蛋白分子类型类似，短线性肽和环肽的从头设计在 2025 年下半年变得明显更加可靠。

多种方法已经在较小规模的实验验证中，展现出稳定的命中率和可复现的结构准确性。

4.2.1 BindCraft

BindCraft 针对多肽设计，引入了一套定制化的计算筛选流程。

在 MDM2 靶标上，BindCraft 设计并合成的 15 条多肽中，有 7 条表现出特异性结合，解离常数（KD）介于 65–165 nM 之间。在 WDR5 的 WBM 位点上，也获得了 6 条结合肽，KD 范围为 219–650 nM。

需要指出的是，该方法在 WDR5 的 WIN 位点上未能获得经验证的结合体。不过，在对 WDR5 WBM 位点中表现最优的多肽进行结构指导的“订书钉化（stapling）”改造后，其亲和力进一步提升了约 6 倍，达到 39 nM。

详情请看：

4.2.2 RFpeptides

RFpeptides 在多个不同靶标上展示了较高的设计效率。

在每个靶标仅测试不超过 20 条设计序列的条件下，该方法成功获得了多种中到高亲和力的结合肽，包括：

  • 针对 MCL1 / MDM2 的 1–10 µM 级别结合肽

  • 针对 GABARAP 的 6 nM 结合肽（IC50 达到亚 nM 水平）

  • 针对 RbtA 的 <10 nM 结合肽，即便仅从序列信息出发进行设计

进一步的 X 射线晶体结构解析表明，在四个目标复合物中，有三个的实验结构与设计模型高度一致（Cα RMSD < 1.5 Å），支持该流程能够在不依赖大规模库筛选的情况下，生成结构准确且亲和力较强的多肽结合体。

4.2.3 PepMLM

PepMLM 是一种仅基于序列信息的线性多肽从头设计方法。

在基于 AlphaFold 的计算对接基准测试之后，作者通过实验验证表明，PepMLM 设计的多肽能够与 NCAM1、AMHR2 等靶标结合，并在多种疾病模型中实现靶向降解作用，包括亨廷顿病模型以及活病毒感染模型。

4.2.4 其他多肽设计工具

除上述方法外，还有多种工具被用于多肽从头设计或优化，包括：

  • PXDesign

  • EvoBind（不支持商业用途）

  • PepTune（不支持商业用途）

这些方法在不同场景下展示了各自的适用性，共同推动了多肽设计在实验层面的可行性提升。

5. GPCRs & Target Engineering

5.1 GPCR Solubilization（GPCR 可溶化）

膜蛋白，尤其是 GPCR，一直是结构生物学和药物研发中最具挑战性的靶标之一。

由于其高度疏水、依赖脂双层稳定存在，许多 GPCR 在脱离细胞膜后会迅速失稳，给表达、纯化以及结构解析带来巨大困难。因此，如何在保持功能的同时实现“可溶化”，成为目标工程中的核心问题。

近年来，一条可行的路径是：通过计算设计，构建可溶且功能保持的膜蛋白类似物。

相关研究表明，研究者已经能够设计出具有复杂拓扑结构的蛋白骨架，并在其中引入源自膜蛋白的功能特征。这类设计在实验中展现出较高的成功率，实质上拓展了“具有功能的可溶蛋白折叠空间”。

在具体流程中，研究者首先利用 AlphaFold2 对不同替换序列进行持续预测和筛选，随后将这些预测结构输入 Soluble ProteinMPNN 进行序列优化。实验结果显示，通过 MPNN 生成的序列在表达和稳定性上具有显著优势，并能较好地维持目标功能。

5.2 WRAPS / AI-designed nano disc alternative proteins

解决膜蛋白稳定性问题的另一种思路，是设计能够替代洗涤剂（detergent）作用的蛋白质。

传统上，膜蛋白在体外稳定往往依赖洗涤剂（detergent）或纳米盘（nanodisc）体系。这一方向中的新进展是：直接从头设计蛋白，使其在没有脂双层的情况下，也能包裹或稳定膜蛋白，并保持水溶性。

研究者在这一背景下提出了一类全新的从头设计蛋白类别——“水溶性 RFdiffusion 两亲性蛋白（Water-soluble RFdiffused Amphipathic Proteins）”。

这类蛋白通过精心设计的两亲性结构，模拟洗涤剂或纳米盘的作用，为膜蛋白提供稳定环境，从而为膜蛋白研究和工程化提供了新的工具路径。

5.3 Stability（稳定性）

无论是膜蛋白工程，还是更广泛的蛋白设计任务，稳定性始终是不可回避的核心指标。

在这一领域，ThermoMPNN 被广泛用于评估点突变对蛋白稳定性的影响。该模型能够对几乎所有可能的单点突变进行 ΔΔG 打分，并在多项基准测试中表现出良好的定量一致性。

在实际应用中，已有使用者观察到 ThermoMPNN 的预测结果与湿实验测量之间具有较好的相关性，使其成为稳定性优化流程中极具实用价值的工具。

5.4 Miniprotein binder design（迷你蛋白结合体设计）

在前文讨论的从头设计策略中，还有一类应用值得单独强调，即迷你蛋白结合体的设计。

这类设计不仅可用于直接阻断或调控靶标功能，还可以通过为目标蛋白“增加体积”，辅助冷冻电镜（Cryo-EM）结构解析，或将蛋白固定在特定的活化/失活构象中。

因此，无论是迷你蛋白结合体设计，还是 VHH（纳米抗体）的设计，其最佳实践在方法论上是高度一致的，通常沿用此前讨论的从头设计与结构优化流程

6. Antibody Informatics（抗体信息学）

在抗体设计与优化流程中，信息学工具扮演着一个“底层支撑”的角色。

它们并不直接生成序列或结构，但为设计决策提供了标准化参照、风险识别以及可开发性判断的依据。

6.1 Numbering（编号体系）

抗体序列的分析，首先依赖于统一的编号体系。

常用的编号方案包括 IMGT、Kabat、Chothia 等。这些体系以不同规则对抗体序列进行标准化编号，使得 CDR 区域与框架区（framework regions）能够被一致、可比地定义。

在采用标准编号之后，研究者便可以在特定位点或特定胚系背景下，比较氨基酸出现的频率，从而识别潜在风险位点、异常突变或罕见残基分布。

这一思路也是诸如 BioPhi 等工具评估“人源化程度（humanness）”的基础：

通过将目标抗体与 OAS（Observed Antibody Space） 等数据库中的人源抗体子集进行比较，判断其在统计层面与人类抗体的接近程度。

6.2 Post-translational Modifications and Liabilities（翻译后修饰与序列风险）

在抗体开发过程中，某些翻译后修饰（PTMs）或序列特征可能带来稳定性或安全性风险，因此需要在早期进行识别。

其中，一部分风险相对容易判断。例如，特定残基模式本身就可能构成潜在问题区域，只需通过序列扫描即可发现。

但也有一些 PTM 风险并不直观，需要借助机器学习方法进行预测。

例如，N-连接糖基化（N-linked glycosylation） 位点的识别，往往依赖于模型预测，其准确性在不同工具和场景中存在差异。

6.3 Scoring & Developability（打分与可开发性）

在抗体设计流程中，越来越多的工具开始对抗体进行多维度的定量评估，以判断其是否具备进入开发阶段的潜力。

例如，Regeneron 开发的 PROPERMAB，便是一类代表性工具，用于系统性评估抗体的可开发性风险。其评估内容包括多个层面：

  • 基础组成与电荷特性

  • 结构衍生特征，例如：

    • 表面patch分布（整体与 CDR 区域）

    • 溶剂可及面积

    • 电荷分布

    • 电偶极与疏水矩

    • 疏水势能评分

    • 空间统计特征（如聚集倾向）

    • 芳香族残基数量

通过将这些特征进行综合分析，可以在设计早期识别出潜在的开发风险，从而减少后续实验与工艺阶段的不确定性。

7. Bioinformatics（生物信息学）

在 AI 驱动的蛋白设计流程中，生物信息学工具更多承担的是“基础设施”角色。

它们并不直接生成结构或序列，但为模型训练、结果评估以及设计决策提供了必要的背景信息与参考坐标系。

7.1 Multiple Sequence Alignment（多序列比对）

多序列比对（MSA）是蛋白信息学中最基础、也最常用的工具之一。

通过对大量同源序列进行比对，可以揭示保守位点、变异模式以及潜在的功能相关区域。

常用的工具包括：

  • MMseqs2

    • 以速度和规模见长，适合在超大序列数据库（如 UniProt）中进行快速聚类与比对，是当前高通量分析中的常用工具。

  • HMMER

    • 基于隐马尔可夫模型，在检测远缘同源序列方面表现突出，常用于蛋白家族与功能域识别。

  • BLAST

    • 经典的启发式局部比对工具，仍然是许多分析流程中的标准选择。

  • IgBlast

    • 针对抗体和免疫球蛋白设计的 BLAST 变体，常用于抗体序列注释与分析。

  • MAFFT

    • 以高精度著称，适合构建高质量的大规模 MSA。

  • Clustal Omega

    • 基于引导树的渐进式比对方法，具有良好的可扩展性。

  • MUSCLE

    • 在速度与准确性之间取得平衡，是多种应用场景下的稳妥选择。

7.2 Databases（数据库）

蛋白设计与分析高度依赖于高质量数据库，这些数据库为模型训练、统计分析和结果验证提供了数据基础。

常用数据库包括：

  • PlabDab

    • 精心整理的抗体序列与结构数据库。

  • SabDab

    • 抗体结构数据库，常用于抗体–抗原结构分析。

  • TheraSabDab

    • SabDab 的治疗性抗体子集，包含可开发性相关注释。

  • PDB

    • 蛋白质和其他大分子三维结构的核心数据库。

  • AlphaFold DB

    • 覆盖超过 2 亿条蛋白序列的预测结构数据库。

  • UniProt

    • 综合性的蛋白序列与功能注释资源。

  • Pfam

    • 基于 HMM 的蛋白家族与结构域数据库。

  • InterPro

    • 整合 Pfam、SMART、TIGRFAM 等多种特征签名的综合注释平台。

  • Observed Antibody Space（OAS）

    • 包含超过 20 亿条原始抗体测序数据，是抗体统计分析与人源化评估的重要资源。

  • CATH / SCOPe

    • 蛋白结构的层级分类体系。

  • GPCRdb

    • 专注于 GPCR 的结构、配体和突变数据。

  • RCSB Ligand Expo

    • 收录 PDB 中出现的小分子化学组分信息。

8. Simulation, Molecular Dynamics & Mechanics（模拟、分子动力学与力学建模）

在 AI 生成结构与序列之后，分子模拟与物理建模往往承担着验证、补充和精细化的角色。

与静态结构预测不同，分子动力学（MD）通过数值积分牛顿运动方程，模拟原子尺度的时间演化过程，从而捕捉蛋白的构象变化、稳定性、结合与解离行为，以及自由能景观。这类方法的时间尺度可以覆盖从飞秒到毫秒不等，适用于研究动态过程和能量驱动的机制。

8.1 分子动力学引擎

目前常用的分子动力学软件包括：

  • OpenMM

    • 基于 GPU 加速、以 Python 为核心接口，便于构建定制化工作流，适合方法开发与高通量模拟。

  • GROMACS

    • 以高性能和并行效率著称，在生物分子模拟中被广泛使用。

  • AMBER（pmemd / sander）

    • 在力场开发和自由能计算方面具有深厚积累，常用于高精度模拟。

  • NAMD

    • 具备良好的可扩展性，适合超大体系模拟，并支持 CHARMM 力场。

  • CHARMM

    • 集成了分子动力学与能量最小化等多种功能，是经典的力学建模工具集。

  • Desmond

    • 支持高通量分子动力学模拟，并提供多种增强采样与自由能计算方法。

  • LAMMPS

    • 架构灵活，除生物分子外，也常用于粗粒化和材料相关模拟。

  • Anton / Anton 2

    • 专用硬件平台，可实现微秒到毫秒级别的长时间尺度模拟。

8.2 结构精修与能量最小化

在结构预测或设计之后，Rosetta Relax / FastRelax 等方法常被用于原子级别的能量最小化与结构精修，以消除不合理构象并优化局部几何。

8.3 增强采样方法

为了更高效地探索构象空间，研究者常结合多种增强采样技术：

  • PLUMED

    • 提供变分自由能、伞形采样、自适应偏置力等多种方法，常作为插件与主流 MD 引擎配合使用。

  • Colvars（NAMD / CHARMM）

    • 支持集体变量定义、复制交换和路径采样等高级策略。

8.4 粗粒化与隐式溶剂模型

在需要更大时间或空间尺度时，粗粒化模型与隐式溶剂框架提供了可行替代方案：

  • MARTINI

    • 广泛应用的粗粒化力场，适用于蛋白、脂质和膜体系。

  • AWSEM / SMOG

    • 基于结构的势能模型，常用于研究折叠路径与动力学机制。

9. Research Groups to Follow（值得关注的研究团队）

在 AI for Proteins 这一快速演进的领域中，一些研究团队持续产出方法、工具和数据资源，构成了当前生态的关键节点。

9.1 Oxford Protein Informatics Group & Deane Lab

Deane 实验室在免疫蛋白的标准化与结构建模方面做出了系统性贡献。

他们主导并维护了多种抗体相关的结构与数据库资源，也是 TAP、AbodyBuilder 等工具的主要开发者之一。同时，该团队在抗体数据库与编号体系的规范化方面发挥了重要作用，为抗体设计和可开发性评估提供了统一参考框架。

9.2 Institute for Protein Design（IPD） & Baker Lab

IPD 与 Baker 实验室是结构驱动蛋白设计领域的核心力量之一。

该团队在从头设计、结构建模和生成式方法方面持续推进前沿研究，同时也是 Rosetta Commons 的重要组成部分。与其相关的实验室还包括 Kuhlman、King、Gray、Huang、Karanicolas、DiMaio 等，共同构成了结构蛋白设计方法的重要源头。

9.3 Zhang Lab

Zhang 实验室以实用型生物信息学工具著称。

他们开发了 I-TASSER、TMalign 等广泛使用的工具，在蛋白结构预测、结构比对和功能注释方面具有长期影响力。这类工具在方法论之外，持续为实际研究提供可靠支撑。

9.4 Microsoft Research

微软研究院近年来在扩散模型和生成式方法方面展开了多项探索，并将这些方法引入蛋白设计相关问题中，为模型架构和训练策略提供了新的思路。

9.5 Chatterjee Lab

Chatterjee 实验室主要关注序列驱动的模型与多肽设计。

他们在蛋白语言模型和肽类分子设计方面开展了多项研究，为不依赖结构信息的设计方法提供了实验验证路径。

9.6 Ovchinnikov Lab

Ovchinnikov 实验室以高可用性的工具开发而受到广泛关注。

他们开发的 ColabFold 显著降低了结构预测的使用门槛，同时也在基于结构预测与系统发育信息的蛋白设计方法上持续推进，兼顾实用性与方法创新。

9.7 Westlake University

西湖大学的团队在结合机器学习与 Rosetta 的从头设计方法方面开展了系统研究，推动了生成式蛋白设计在实验层面的应用。

9.8 ProTrek & related work

围绕 ProTrek 语言模型的一系列研究，展示了序列表示学习在蛋白设计中的新可能性，并伴随有实验验证，为语言模型在该领域的应用提供了新的参考范式。